Aprotinină CAS 9087-70-1

Aprotinină78R2S7, formula moleculară C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Este un inhibitor de protează care poate inhiba tripsina și chimotripsina, împiedică activarea altor proteazomi activi în pancreas și autoactivarea tripsinogenului. Folosit clinic pentru prevenirea și tratarea pancreatitei acute, a sângerărilor cauzate de fibrinoliză și a coagulării intravasculare diseminate. Poate fi folosit și pentru tratament anti-șoc. Inhibitorii de protează sunt substanțe care se pot lega de enzime și pot reduce rata de degradare a substratului. Inhibitorii de protează cu proprietăți proteice sunt prezenți pe scară largă și din boabe de soia au fost izolate două tipuri de inhibitori de protează cu proprietăți proteice: inhibitorul de tripsină Kuniz și inhibitorul Baumann Bellck. Primul are o greutate moleculară de 20-25 ku, în timp ce cel din urmă are o greutate moleculară de 8 ku.

Recombinantaprotinină(RTI16) poate inhiba kininaza și tripsina și este un inhibitor natural ne-serin protează. Este o proteină bazică cu un singur lanț, compusă din 58 de reziduuri de aminoacizi, cu 3 legături disulfură încrucișate-în lanț. Multă vreme, aprotinn a fost folosit pentru tratamentul pancreatitei acute. După anii 1990, aprotina recombinantă a început să fie utilizată în chirurgia cardiotoracică pentru a proteja trombocitele, a reduce sângerarea și exsudația și pentru tratamentul clinic al pacienților cu tulburări de coagulare. Prin urmare, dimensiunea pieței aprotinnei s-a extins rapid și a devenit unul dintre medicamentele biochimice importante.

Sinteză

 

În prezent, preparatele de aprotinnă recombinată disponibile comercial sunt în principal extracte din organe precum plămânii de bovine, care au procese complexe și costuri ridicate. Prin urmare, este de mare importanță să explorezi producția de aprotinnă recombinată folosind metode de inginerie genetică.

Când se utilizează un sistem de exprimare a secreției, producția de aprotinnă este în general scăzută, iar activitatea produsului rezultat este, de asemenea, scăzută. Prin expresia prin fuziune, este de așteptat să crească foarte mult nivelul de expresie al aprotinei recombinate.

 

În acest scop a fost construită o plasmidă recombinantă de expresie a aprotinnei pGrxA BPTI și a fost proiectat un situs de recunoaștere pentru FXa între partenerul de fuziune și aprotinna recombinată. După ce a fost exprimat sub formă de corp de incluziune, partenerul de fuziune a fost purificat și repliat prin filtrare pe gel. Partenerul de fuziune a fost excizat de FXa pentru a obține o proteină cu aceeași activitate ca produsul natural. Prin optimizarea condițiilor de expresie, randamentul a fost îmbunătățit semnificativ în comparație cu sistemele de expresie anterioare.

Optimizarea exprimării bacteriilor de inginerie:

 

Se inoculează bacteriile din tub de glicerol pe plăci de agar LB/AMP, se cultivă la 37 de grade timp de 20 de ore, se răzuiește coloniile și se inoculează în 5 ml de mediu lichid LB/AMP la 37 de grade, 200 r/min și se cultivă peste noapte. Se inoculează 5% din inocul în 100 ml de mediu de suspensie de porumb, se cultivă la 37 de grade și 220 r/min pe un agitator, se induce timp de 7 ore și apoi se centrifughează (8000 r/min, 5 min, 4 grade) pentru a colecta celulele bacteriene. Cântăriți greutatea umedă a celulelor bacteriene și detectați expresia acestora cu 15% SDS-PAGINA.

Cultivarea în rezervoare de fermentație

 

Cultivarea în rezervoare de fermentație:

Folosind un rezervor de fermentare German Biostat 30 L, la 37 de grade, cu oxigen dizolvat controlat la 20%, pH 7,0. Folosind un rezervor de fermentație pentru a exprima proteina de fuziune, s-au obținut 260 g de celule bacteriene umede din 16 L de bulion de fermentație, aproximativ 16 g/L; Nivelul de expresie este de aproximativ 45%,

Ruperea peretelui și achiziționarea corpului de incluziune a celulelor bacteriene:

 

După finalizarea cultivării, colectați celulele bacteriene, adăugați 1 g de celule bacteriene la 10 mL de soluție A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), suspendați-le bine, sonicați celulele într-o baie de gheață, lucrați timp de 30 de secunde, interval de 140 de secunde, putere de 140 de secunde W. Transferați lichidul într-un tub de centrifugă, centrifugeți la 4 grade și 8000 r/min timp de 15 minute, iar precipitatul este corpul de incluziune brut.

Prepararea soluției de dizolvare a corpului de incluziune:

 

Spălați corpul de incluziune brut cu soluția B (50 mmol/L Tris HCI, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) de două ori, de fiecare dată timp de 0,5 ore, centrifugați pentru a îndepărta supernatantul și obțineți corpuri de incluziune relativ pure. Se adaugă 1 g de corpuri de incluziune la 5 ml de soluție C (50 mmol/L Tris HCI, pH 8,0, 8 mol/L uree, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), se incubează peste noapte la 4 grade, se denaturază și se dizolvă, se centrifughează la 12000 r/min, pentru a se colecta dizolvantul de 15 min./min. solutie. Obțineți aprotinnă recombinată.

Efecte farmacologice:

 

 

Aprotininăinhibă tripsina umană, enzima fibrinolitică, plasmă și angiotensina tisulară prin complecșii inhibitori de enzime reversibile formați într-un anumit raport chimic. Proteazele cu activitate serină joacă un rol major în sistemul kininogen kininei vasopresină, sistemul complementului și sistemul de coagulare, unde plasmina și vasopresina plasmatică joacă roluri critice.

 

Aprotinn își exercită efectul inhibitor prin formarea unui complex de aprotinn protează prin porțiunea serină activă de pe enzimă. Cu toate acestea, atunci când este combinat cu diferite proteaze, prezintă diferite constante de disociere. Legarea cu tripsina este cea mai puternică (Ki=0.06nmoN), care este una dintre cele mai scăzute constante raportate în interacțiunile dintre proteine-(Laydunski și colab.. 1974). Legarea cu enzima fibrinolitică umană nu este foarte puternică. Datorită valorii ridicate a K a complexului inhibitor al enzimei (Ki=1 nmoN), acesta poate fi reversibil (Wimann, 1980), iar complexul care se leagă de angiotensina plasmatică umană este destul de slab (Ki{{=30 nmol/l), dar încă în intervalul terapeutic al aprotinei (Nakahara, 1983).

 

Aprotinn nu se leagă numai de moleculele de enzime libere, ci și de enzimele care s-au legat deja de o a treia componentă (dacă centrul activ al enzimei are încă capacitatea de legare). Prin urmare, aprotinna inhibă enzimele fibrinolitice libere și poate, de asemenea, inhiba complexul intermediar al fibrinolizin-kinazei în lanț format în timpul terapiei trombolitice cu lanț-kinază (Wimann, 1980).
Efectul antifibrinolitic al aprotinnei se bazează pe inhibarea plasminei activate prin hidroliza proteinelor. Spre deosebire de solvenții sintetici antifibrinolitici, datorită inhibării directe a plasminei supraactivate, aprotinna nu numai că protejează substratul direct (fibrina) de degradarea de către plasmină, dar protejează și fibrinogenul, factorii V și VIII în plasmă și alfa 2-globulina în ser.

 

În experimentele de șoc indus de endotoxină și șoc hipovolemic, Trasylol poate inhiba semnificativ activarea kininogenului. (Massion și colab., 1972).
Trasilolul poate preveni sau întârzia dezvoltarea edemului interstițial pulmonar (plămân de șoc). Efectul său inhibitor este dependent de doză-și de timp-(Lorthioir și colab., 1973).
În timpul șocului, pancreasul ischemic poate produce o substanță peptidică foarte toxică, și anume factorul inhibitor miocardic (MDF). Acest factor este strâns legat de moartea prin șoc.

 

MDF poate fi detectat în plasma șoarecilor, câinilor, maimuțelor și oamenilor cu șoc hemoragic, septic, cardiogen și șoc de arsură. MDF poate provoca o scădere a contractilității miocardice în toate cazurile de sângerare și, în același timp, provoacă contracția vaselor de rezistență viscerală, ducând la ischemie locală și la producerea mai multor MDF. Mai mult, din cauza daunelor toxice cauzate sistemului reticuloendotelial, clearance-ul acestuia în fluxul sanguin este întârziat. Trasylol poate preveni foarte mult producția de MDF (Lefer 1984).

Aprotinină, ca un compus cu moleculă mică care rezistă la fibrinoliză, prezintă proprietăți semnificative și specifice de inhibiție a enzimei. Nu numai că inhibă eficient activitatea tripsinei, dar acționează și asupra altor enzime proteolitice înrudite, jucând astfel un rol important în experimentele de biologie celulară. În special în timpul lizei și omogenizării celulelor și țesuturilor, Aprotinn poate servi ca un inhibitor eficient de protează, prevenind eficient degradarea accidentală a proteinelor țintă, ceea ce este crucial pentru menținerea integrității și acurateței probei.

Efectul inhibitor al Aprotinn arată o dependență clară de doză, adică pe măsură ce concentrația sa crește, efectul inhibitor asupra activității fibrinolitice crește în mod corespunzător. Această caracteristică permite cercetătorilor să controleze mai precis condițiile experimentale pentru a obține rezultate experimentale mai fiabile și reproductibile. Între timp, Aprotinn poate prelungi și timpul de coagulare a sângelui, confirmând și mai mult rolul său important în mecanismul de coagulare. Experimentele in vitro au arătat că Aprotinn este un inhibitor eficient al căii de coagulare endogenă care poate interfera și regla procesele cheie în procesul de coagulare.

Aprotini și-a demonstrat și efectele farmacologice unice. Poate inhiba semnificativ procesul de dizolvare a cheagurilor de sânge in vitro, poate prelungi timpul de sângerare pentru tăierea cozii la șobolani și poate prelungi timpul de coagulare în plasma umană. Aceste descoperiri sugerează că Aprotinn poate avea potențiale efecte anti sângerare și anti trombotice. Pentru a valida în continuare efectul său in vivo, cercetătorii au efectuat experimente pe un model de scurtcircuit arteriovenos de șobolan. Rezultatele au arătat că Aprotnin poate reduce semnificativ greutatea cheagurilor de sânge, susținând și mai mult potențialul său ca medicament antitrombotic.

În rezumat, Aprotnin, ca un compus cu moleculă mică care inhibă fibrinoliza, a demonstrat proprietăți semnificative de inhibiție a enzimelor și efecte farmacologice atât in vitro, cât și in vivo. Aplicarea sa în experimentele de biologie celulară oferă cercetătorilor instrumente puternice, în timp ce descoperirile sale din studiile in vivo oferă indicii importante și bază pentru dezvoltarea sa ca medicament anti sângerare și anti trombotic. În viitor, odată cu cercetările suplimentare privind mecanismul de acțiune al Aprotnin și studiile clinice, se așteaptă să vedem aplicarea sa mai largă în domeniul medical.

Tag-uri populare: aprotinină cas 9087-70-1, furnizori, producători, fabrică, en-gros, cumpărare, preț, vrac, de vânzare