GLP-1(legătură:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3}.html) este un hormon polipeptidic format din 30 de aminoacizi. Odată cu cercetările aprofundate privind GLP-1, au fost dezvoltate tot mai multe metode sintetice. Acest articol va introduce în mod sistematic metodele de sinteză cunoscute în prezent ale GLP-1.
Metoda 1, sinteza în fază solidă:
Sinteza în fază solidă este o metodă utilizată pe scară largă pentru sinteza peptidelor și proteinelor și este, de asemenea, utilizată în mod obișnuit pentru sinteza GLP-1. În sinteza în fază solidă, structura miezului este formată prin legarea primului aminoacid la rășină. Apoi, următorul aminoacid este adăugat în secvență și reacționat chimic cu un agent de condensare adecvat. În cele din urmă, produsul țintă poate fi obținut prin scindarea polipeptidei din rășină.
Importanța sintezei în fază solidă este că permite automatizarea și producția pe scară largă a sintezei de peptide. Metodele curente de sinteză în fază solidă includ Fmoc și Boc. Printre acestea, metoda Fmoc folosește gruparea de protecție N-Fmoc pentru a proteja peptida, în timp ce metoda Boc folosește terț-butiloxicarbonil pentru a proteja gruparea carboxil.
Metoda a doua, sinteza în fază lichidă:
Sinteza în fază lichidă este o metodă tradițională de sinteză a peptidelor în care reactanții sunt plasați în faza lichidă pentru reacție. Avantajul sintezei în fază lichidă este că condițiile de reacție sunt blânde și potrivite pentru modificarea structurilor chimice sensibile. Cu toate acestea, din cauza prea multor reactanți, procesul de purificare este relativ greoi. Reacțiile chimice în sinteza în fază lichidă includ:
1. Reacția de condensare:
Reacția de condensare este una dintre cele mai de bază reacții în sinteza peptidelor, adică gruparea carboxil inițiată de agenții de condensare precum DCC și HOBt este conectată la gruparea amino a aminoacizilor prin reacția de acilare. Condițiile de reacție sunt blânde și randamentul este mare.
2. Reacții de eliminare:
Reacția de eliminare este de a reduce metionina la ditiol de către NaBH4 și alți agenți reducători, făcându-l inactiv. Reacția trebuie efectuată în condiții de bază.
3. Îndepărtarea grupărilor protectoare:
Datorită diferitelor funcții ale aminoacizilor din lanțul peptidic, pentru protecție vor fi utilizate diferite grupări protectoare. După ce sinteza este completă, gruparea protectoare trebuie îndepărtată. Pentru metoda Fmoc, piperidina este de obicei utilizată pentru a elimina Fmoc; în timp ce pentru metoda Boc, TFA este folosit pentru a elimina Boc.
Metoda trei, sinteza chimică:
GLP-1 este un hormon polipeptid cu activități biologice importante. Sinteza sa poate fi realizată prin diverse metode, printre care sinteza chimică este una dintre cele mai frecvent utilizate metode. Avantajul sintezei chimice este că poate produce produse țintă foarte pure, care sunt potrivite pentru producția pe scară largă. Metoda de sinteză chimică și pașii detaliați ai BPL-1 vor fi introduse mai jos.
1. Calea sintetică și selecția grupului de protecție:
Molecula GLP-1 constă din 36 de aminoacizi, inclusiv 21 de aminoacizi de tip L și 15 aminoacizi de tip D. Înainte de a efectua sinteza, este necesar să se selecteze o cale sintetică adecvată și să se selecteze grupul de protecție corespunzător în funcție de condițiile sintetice. Sinteza în fază solidă Fmoc este de obicei utilizată pentru sinteza automată la scară largă. Această metodă utilizează protecția cu N-9-fluoroimido carboxil (N-Fmoc) ca grupare de protecție și, de asemenea, trebuie să selecteze o grupare de protecție secundară adecvată (cum ar fi terț-butil sau metil) pentru a asigura protecția unor situsuri specifice. De fiecare dată când se adaugă un nou aminoacid, gruparea de protecție Fmoc trebuie îndepărtată mai întâi, apoi se adaugă substanța de cuplare protejată a următorului aminoacid.
2. Sinteza secvenței de aminoacizi de bază:
Secvența de bază a GLP-1 constă din 21 de aminoacizi, inclusiv o serină cheie și patru secvențe dipeptidice de acid prolil-glutamic. În sinteza în fază solidă, sinteza secvenței de bază poate fi împărțită în următorii pași:
2.1. Adăugați carbamat de acid acetic (Fmoc-NH-CH2CO2Et) și 2-Cl-Trt-Cl la rășina sintetică în fază solidă și efectuați reacția de condensare cu agent de cuplare DIC/NMM.
2.2. Îndepărtați gruparea de protecție Fmoc prin reacția de deprotejare a grupului.
2.3. Adăugați următorul aminoacid, repetați pasul 1 și pasul 2 în secvență până când secvența de bază este sintetizată.
2.4. Formarea structurilor pentapeptidice pe rășină în fază solidă. Adăugați reactivul de acetalizare la rășina în fază solidă, reacționați cu agentul de recunoaștere N-terminal (cum ar fi HBTU), adăugați grupul de protecție a lanțului lateral de serină ca agent reducător auxiliar și apoi îndepărtați grupul de protecție Fmoc.
2.5. Sub cataliza transferazei Bacillus subtilis (ProTide), structura pentapeptidei suferă o reacție de schimb cu precursorul iodoacetatului de serină.
3. Sinteza secvenței de aminoacizi rămase:
După finalizarea sintezei secvenței de bază, este necesar să se adauge în continuare aminoacizii rămași, inclusiv aminoacizii de tip L și D. Adăugarea acestor aminoacizi trebuie să înceapă de la secvența de bază, să adauge următorul aminoacid în secvență și să folosească agentul de condensare corespunzător pentru a efectua reacții chimice până când este sintetizată o moleculă de polipeptidă GLP-1 completă. În timpul acestui proces, este de asemenea necesar să se selecteze o grupare protectoare adecvată după cum este necesar și să se efectueze etapele de reacție, îndepărtarea grupării protectoare și adăugarea de aminoacid în secvență.
4. Tratament cu hidroxid de sodiu:
După ce toți aminoacizii au fost adăugați, pe rășina în fază solidă se formează un lanț peptidic incomplet sintetizat și trebuie procesat pentru a forma o moleculă peptidică complet formată. În primul rând, peptida neformată ar trebui să fie hidrolizată cu hidroxid de sodiu, astfel încât gruparea carboxil C-terminală atașată inițial la rășină să fie desprinsă de rășină, iar gruparea protectoare să fie detașată în apă. După reacția de hidroliză, se obține produsul țintă.
5. Precipitații și spălare:
După tratament, soluţia hidrolizată este tratată cu acid pentru a precipita produsul ţintă. Apoi, granula a fost resuspendată în apă, urmată de spălare intensivă pentru a îndepărta impuritățile.
6. Purificare:
Etapa finală este purificarea produsului dorit, de obicei folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță. În timpul acestui proces, puritatea produsului poate fi determinată prin detectarea vârfului soluției în spectrul de masă. Pe scurt, sinteza chimică a GLP-1 necesită mai multe runde de reacții complexe și procese stricte de purificare pentru a obține în final produsul țintă activ.
Metoda patru, biosinteză:
GLP-1 este un hormon polipeptidic important cu diferite efecte fiziologice, inclusiv promovarea secreției de insulină, suprimarea apetitului, reducerea greutății corporale și menținerea sensibilității la insulină etc. Metoda de biosinteză a GLP-1 este sintetizată în principal de celulele L în glanda pancreatică, iar rata de sinteză a acesteia este reglată cu aportul alimentar. Pașii detaliați sunt introduși după cum urmează:
1. Lucrări pregătitoare înainte de sinteză:
Înainte de biosinteza GLP-1, trebuie făcute unele lucrări pregătitoare, inclusiv determinarea tipului de celulă utilizat, stabilirea condițiilor de cultură și selectarea enzimei catalitice adecvate. Celulele L sunt sursa principală a sintezei GLP-1, deoarece conțin precursori ai doi hormoni, GIP (peptidă asemănătoare glucagonului 1) și GLP-1. Celulele L pot fi izolate din epiteliul intestinal al iepurilor sau șoarecilor. Înainte de biosinteză, celulele trebuie cultivate într-un număr suficient și trebuie furnizate suficiente nutrienți și condiții de cultură adecvate. În plus, este necesar să se selecteze enzima catalitică adecvată pentru a promova reacția.
2. Sinteza și prelucrarea precursorilor:
Biosinteza GLP-1 are loc în principal în celulele L, iar precursorul său este compus din doi hormoni, GIP și GLP-1. După intrarea în celulele endocrine, GIP și GLP-1 sunt procesate de enzimele proteolitice și scindate în peptide individuale. O serie de enzime și cofactori sunt implicați în acest proces, inclusiv precursorul polipeptid acidaza (PC2), izomeraza și factorii de adeziune târzie.
3. Conversie reciprocă între segmentele polipeptidice:
După procesare, peptidele GIP și GLP-1 sunt recombinate pentru a forma polipeptida GLP-1. Acest proces necesită utilizarea peptidei asemănătoare glucagonului 1 (GLP-1) ca șablon la care alte peptide individuale sunt combinate pentru a forma noi polipeptide compozite. Acest proces necesită, de asemenea, unele enzime și factori specifici, inclusiv Prohormone Convertaza 1/3 (PC1/3) și Carboxipeptidaza E (CPE).
4. Secretia GLP-1:
După ce GLP-1 este sintetizat și procesat, acesta este stocat în citoplasmă și veziculele interne ale celulelor endocrine. Când sunt stimulate de dietă, celulele endocrine eliberează GLP-1 și intră în circulația sângelui prin microvase. Acest proces este reglat și controlat printr-o serie de căi de transducție a semnalului, inclusiv cAMP-Ca2 plusși așa mai departe.
Pe scurt, biosinteza GLP-1 implică acțiunea comună a mai multor legături și factori. Combinația dintre biosinteză și sinteza chimică poate oferi o bază și un sprijin mai bun pentru cercetarea și producția de GLP-1.
Metoda cinci, sinteza enzimatică:
Sinteza enzimatică este sinteza lanțurilor peptidice prin cataliza enzimelor biologice. În comparație cu metodele tradiționale de sinteză în fază lichidă, sinteza enzimatică poate fi efectuată la temperatura camerei și poate fi selectată o gamă largă de materii prime. Enzime precum teta-sintaza lichidă, AEP, ACE etc. sunt de obicei folosite pentru a cataliza sinteza.
În concluzie, metodele menționate mai sus sunt metode fezabile pentru sinteza GLP-1. Diferite metode sunt potrivite pentru diferite condiții experimentale și medii de producție farmaceutică.