Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Cunoașteți streptavidina
Streptavidina (SA), o proteină secretată derivată din Streptomyces avidinii, are o greutate moleculară de aproximativ 65-66 kDa și un punct izoelectric de aproximativ 6,0. Este o proteină tetramer compusă din patru subunități omoloage, fiecare cu un situs independent de legare a biotinei - ceea ce înseamnă că o moleculă de streptavidină se poate lega simultan la patru molecule de biotină. Constanta de disociere (Kd) dintre cele două este de aproximativ 10 ⁻¹⁵ M, care este una dintre cele mai puternice interacțiuni biologice necovalente cunoscute și poate fi privită drept cel mai precis „mecanism de blocare moleculară” din natură.

În comparație cu avidina derivată din albușul de ou, are avantaje de neegalat:

Nu conține modificări de glicozilare, este neutru din punct de vedere electric, prin urmare are o legare ne-specifică extrem de scăzută în condiții fiziologice, un fundal experimental curat și un raport semnal-la-excelent. În plus, rezistența sa excelentă la denaturare și degradarea proteazei, precum și capacitatea sa de a rezista la pH extrem, temperaturi ridicate (70-80 grade C), solvenți organici și agenți de denaturare convenționali (cum ar fi SDS și uree), au înlocuit avidina și au devenit „standardul de aur” incontestabil în sistemele de legare a biotinei.

Tocmai prin aceste caracteristici remarcabile strălucește în domenii precum științele vieții, diagnosticarea in vitro, screeningul medicamentelor și biosensing.

2. Testarea imunității
Aplicația în domeniul detectării imune este cea mai clasică și utilizată aplicație a sa. De la dezvoltarea sa la sfârșitul anilor 1970, sistemul de biotină streptavidină (BAS) a devenit piatra de temelie a etichetării imune și a analizei de urmărire datorită afinității sale ultra-înalte și a efectului de amplificare în cascadă. Conform statisticilor, aproximativ 85% dintre analizoarele obișnuite de chemiluminiscență folosesc metode de detectare bazate pe BAS, indicând poziția lor dominantă.

2.1 Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA)

În ELISA, peroxidaza de hrean (HRP) sau fosfataza alcalină (AP) pot fi cuplate și enzima poate fi ghidată cu precizie către țintă prin anticorpi biotinilați. HRP catalizează substraturile luminiscente TMB, DAB sau ECL pentru a produce semnale chimice sau optice puternice, în timp ce AP catalizează BCIP/NBT, PNPP și alte substraturi pentru a produce semnale stabile de culoare sau chemiluminiscență. O moleculă țintă biotinilată se poate lega de streptavidină marcată multiplă, realizând amplificarea semnalului pe mai multe-nivele și făcând posibilă detectarea țintelor cu abundență scăzută. Această tehnologie este utilizată pe scară largă în ELISA sandwich și competitivă, acoperind scenarii precum cuantificarea proteinelor, detectarea anticorpilor, screeningul patogenului etc.

2.2 Imunoblot de proteine ​​(Western Blot)
În Western Blot, legarea cu anticorpi secundari biotinilați poate crește semnificativ intensitatea semnalului proteinelor țintă pe filmele de transfer. În comparație cu sistemele tradiționale de anticorpi secundari, sistemele BAS pot obține o amplificare mai puternică a semnalului datorită proprietăților lor de legare tetravalentă. În plus, datorită legării ne-scăzute a streptavidinei, interferența de fond este redusă semnificativ, făcându-le deosebit de potrivite pentru analiza cantitativă a proteinelor cu abundență scăzută.

2.3 Imunohistochimie (IHC) și imunocitochimie (ICC)
Streptavidina marcată cu HRP sau marcată AP este instrumentul preferat de amplificare a semnalului pentru IHC și ICC. Sistemul HRP este potrivit pentru experimente care necesită o sensibilitate de detecție extrem de ridicată, în timp ce sistemul AP este potrivit în special pentru sistemele care conțin inhibitori HRP (cum ar fi azida de sodiu) sau scenarii experimentale care necesită-dezvoltarea pe termen lung a culorii și stabilitatea semnalului. Prin legarea de sonde sau anticorpi biotinilați la conjugații de streptavidină, moleculele țintă pot fi localizate cu precizie în secțiuni de țesut sau probe de celule.

2.4 Imunofluorescență (IF) și hibridizare in situ (ISH)

Streptavidina marcată cu fluoresceină (cum ar fi FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) este un instrument de vizualizare universal pentru colorarea prin imunofluorescență și hibridizarea in situ. Markerul FITC are o lungime de undă de excitație/emisie de aproximativ 494/519 nm și prezintă fluorescență verde strălucitor; Lungimea de undă de excitație/emisie a markerului PE este de aproximativ 565/578 nm, care este „standardul de aur” pentru analiza citometriei în flux multi-color; Markerul APC acoperă spectrul roșu îndepărtat, facilitând imaginea multi-color. Acești markeri fluorescenți se pot lega cu precizie de anticorpi biotinilați sau de sonde de acid nucleic pentru a realiza analiza de localizare și detectarea cantitativă a moleculelor țintă.

2.5 Citometrie în flux (FACS)

În citometria în flux, streptavidina marcată fluorescent (în special marcată PE) este utilizată pentru a detecta antigenele de suprafață celulară marcate cu anticorpi biotinilați. Luminozitatea sa excelentă oferă un raport semnal-la-extrem de mare, care poate detecta eficient populațiile de celule cu expresie scăzută a antigenului de suprafață sau semnale slabe. Este un reactiv indispensabil în analiza citometriei în flux multi-culoare.

2.6 Testul imunospot legat de enzime (ELISPOT)
Streptavidina marcată cu AP prezintă performanțe excelente în ELISPOT și este potrivită pentru analiza în fază solidă-și sistemele de colorare a țesuturilor/celulelor. Poate cataliza stabil producția de substrat de semnale punctuale numărabile pentru detectarea secreției de citokine la nivel de celule unice-.

3. Purificarea proteinelor și acizilor nucleici
3.1 Cromatografia de afinitate și purificarea proteinelor
Streptomicina este componenta de bază a ambalajului cromatografiei de afinitate. După marcarea cu biotină a proteinei de purificat, aceasta este amestecată cu gel de streptavidină agaroză (cum ar fi Streptavidin Agarose/Sepharose), iar proteina marcată se va lega strâns de streptavidină de pe material de umplutură. Prin spălare pentru a îndepărta impuritățile și apoi spălarea proteinei țintă în condiții adecvate (cum ar fi tampon SDS-PAGE de fierbere, tratament SDS 0,1% sau tratament cu 95% formamidă+10 mM EDTA la pH 8,2), se pot obține produse de puritate-înaltă.

Luând ca exemplu producția industrială de insulină umană recombinantă, granulele magnetice de streptavidină{0}}de înaltă calitate pot lega mai mult de 1200 pmol de biotină liberă per miligram, iar puritatea proteinei purificate poate atinge peste 95%.

3.2 Imunoprecipitarea (IP) și imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)
Aplicarea granulelor magnetice de streptavidină în imunoprecipitare îmbunătățește foarte mult eficiența experimentală. Cercetătorii pot fixa anticorpi biotinilați pe margele magnetice de streptavidină și le pot incuba împreună cu lizat de celule.

Anticorpii captează în mod specific proteina țintă și proteinele ei care interacționează, formând un complex de „proteine ​​țintă de anticorpi de mărgele magnetice”. Poate fi separat rapid sub actiunea unui camp magnetic extern, cu operare simpla si sensibilitate ridicata. În experimentele ChIP, margele magnetice de streptavidină au fost, de asemenea, folosite pentru a captura complexe de proteine ​​ADN biotinilate și pentru a studia interacțiunea dintre proteine ​​și ADN.

3.3 Experimentul trage în jos
În studiul interacțiunilor dintre proteine-proteine, margele magnetice pot capta proteine ​​de momeală biotinilate și apoi „pește” pentru pre-proteinele care interacționează cu acestea. De exemplu, atunci când se studiază căile cheie de semnalizare în celulele tumorale, anticorpii specifici care recunosc proteina P53 sunt imobilizați pe margele magnetice de streptavidină și incubați împreună cu lizat de celule tumorale pentru a îmbogăți eficient P53 și proteinele asociate acestuia. În comparație cu metodele tradiționale de imunoprecipitare, mărgele magnetice IP are o sensibilitate și specificitate mai ridicate și poate îmbogăți mai eficient proteinele țintă cu abundență scăzută.

3.4 ARN-ul Trage-în jos
Granulele magnetice sunt, de asemenea, potrivite pentru experimentele de tragere-down ARN. După legarea cu margele magnetice de streptavidină, sondele de ARN biotinilate pot capta proteine ​​care interacționează cu ARN-ul din lizatele celulare pentru studiul rețelelor de interacțiune cu proteinele ARN.
3.5 Prepararea ADN-ului monocatenar și extracția acidului nucleic
Se poate lega cu oligonucleotidele biotinilate pentru prepararea ADN-ului monocatenar și extracția eficientă a acizilor nucleici, jucând un rol important în clonarea moleculară și ingineria genetică.

4. Detecție cu randament ridicat și screening de droguri
4.1. Platforma de testare TR-FRET
Poate fi cuplat cu chelați luminiscenți, cum ar fi chelații de europiu, pentru a realiza legătura semnalului și captarea moleculară în sistemul de detecție TR-FRET (transfer de energie prin rezonanță fluorescentă rezolvată în timp-). De exemplu, streptavidina marcată cu europiu THUNDER ™ concepută special pentru platforma experimentală TR-FRET se poate lega stabil de diferite molecule modificate biotinilate și este utilizată pe scară largă în analiza interacțiunii proteinelor și screeningul preliminar al medicamentelor țintă.

Acest sistem este omogen și de{0}}performanță mare, ceea ce îl face un instrument puternic pentru dezvoltarea de medicamente moderne.

4.2 Livrarea țintită a medicamentelor
Proprietățile sale de legare a biotinei îl fac un purtător ideal pentru sistemele de administrare țintită a medicamentelor. Prin cuplarea moleculelor de medicament cu biotină și prin utilizarea capacității de legare țintită a streptavidinei, se poate obține livrarea precisă a medicamentului, îmbunătățind eficiența tratamentului și reducând efectele secundare.

4.3 Biosenzori și biocipuri

Este materialul de bază pentru producția de biosenzori și biocipuri. Prin imobilizarea streptavidinei pe suprafața cipului ca element de captare, sondele de proteine ​​marcate cu biotină sau anticorpii pot fi imobilizați pe aceasta, obținând o detecție cu-debit și sensibilitate ridicată-. De exemplu, la screeningul timpuriu al cipurilor proteice pentru boli cardiovasculare, margele magnetice de streptavidină sunt fixate pe substratul cipului și sunt utilizate pentru a lega sondele de proteine ​​biotinilate. Acest lucru poate detecta cu acuratețe anomalii la pacienții în stadiile incipiente ale bolii și atunci când concentrațiile markerilor din sânge sunt la fel de scăzute ca cTnI de 0,01 ng/mL, avansând fereastra de diagnostic cu 2-3 ore în comparație cu metodele tradiționale de diagnostic.

5. Biologie celulară și imagistică
5.1 Etichetarea suprafeței celulare și sortarea celulelor fluorescente
Streptavidina marcată fluorescent (cum ar fi Vari Fluor 488 Streptavidin) este utilizată pe scară largă pentru marcarea suprafeței celulare și sortarea celulelor fluorescente. Spectrul său de emisie acoperă întregul spectru de lumină vizibilă și aproape-infraroșu, iar în experimente de etichetare multi-culoare, poate intra cu ușurință în nucleul și structura citoplasmatică, etichetând proteinele țintă pentru imagistică și analiză.

5.2 Nanotehnologie și autoasamblare a materialelor
Proprietățile sale de legare tetravalentă îl fac o „punte” ideală pentru auto{0}}asamblarea nanomaterialelor. Prin legarea țintită a streptavidinei biotinei, pot fi construite diferite nanostructuri pentru cercetări interdisciplinare, cum ar fi imagistica biologică și monitorizarea mediului.

6. Anticorp anti streptavidină
Odată cu utilizarea pe scară largă a sistemului de biotină streptavidină, a apărut o problemă adesea trecută cu vederea - anticorpii endogeni anti streptavidină (ASA) din probă pot interfera cu sistemul de detectare. Cercetările au descoperit că legarea ASA de SA în sistemul de reacție poate afecta construcția corectă a sistemelor de anticorpi antigeni specifici, rezultând în acuratețea compromisă a rezultatelor de cuplare, detecție sau diagnosticare.

Pentru a face față acestei provocări, au apărut kituri de detectare a anticorpilor anti streptavidină, care pot fi utilizate pentru a detecta ASA endogen în probele de pacienți și pentru a evita interferența acestuia cu sistemul BAS. Roche Custom Biotech a dezvoltat un mutant inactiv de streptavidină (Streptavidin rec. inactive, poly), care poate fi adăugat la sistemul actual fără pași suplimentari pentru a bloca și a elimina în mod specific interferența ASA, îmbunătățind acuratețea și specificitatea sistemului de detectare.

7. Interferența biotinei
Deși sistemul de biotină cu streptavidină este puternic, se confruntă cu o provocare din ce în ce mai severă - interferența cu biotină.

Când există o concentrație mare de biotină liberă în proba de testare, aceasta concurează cu anticorpii biotinilați pentru locul de legare al streptavidinei, rezultând rezultate de detecție distorsionate.

Administrarea orală a 100 mg biotină poate duce la o concentrație plasmatică maximă de 375-450 ng/mL; Pacienții cu scleroză multiplă pot lua 300 mg/zi pe cale orală, iar nivelurile lor plasmatice de biotină pot depăși 1000 ng/mL; Aportul zilnic de 500 mg de biotină poate duce la concentrații extrem de mari de biotină în sânge. În imunotestele tip sandwich, biotină excesivă poate produce rezultate scăzute eronate; În imunotestele competitive, poate duce la rezultate ridicate eronate.

Numeroase studii au arătat că, TSH, Tiroxină PTH, teste endocrine precum hormonul adrenocorticotrop, prolactina, testosteronul, cortizolul, precum și markerii tumorali și markerii funcționali cardiaci, sunt toate afectate în diferite grade de interferența biotinei. FDA a emis succesiv informații de avertizare și linii directoare corespunzătoare. Strategiile de adaptare includ: diluarea în serie a probelor, trecerea la metode non-BAS, cum ar fi cromatografia lichidă-spectrometria de masă, retestarea după eliminarea biotinei (în scurt timp de 2 ore, până la 15 zile sau chiar luni) sau utilizarea absorbanților liberi de biotină.